产品货号:
ALH108
中文名称:
全血基因组DNA快速提取试剂盒
英文名称:
Whole blood genomic DNA extraction kit
产品规格:
50T|100T|200T
发货周期:
1~3天
产品价格:
询价
本试剂盒适用于从小量全血样本中快速提取基因组DNA。独特的结合液/蛋白酶K迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶,然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜,再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤,抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物、蛋白等杂质去除,最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。
- 不需要使用有毒的苯酚等试剂,也不需要乙醇沉淀等步骤。
- 快速简捷,单个样品操作一般可在20分钟内完成。
- 多次柱漂洗确保高纯度,典型的产量200μL全血可提取出3~12μg,OD260/OD280典型的比值达1.7~1.9,长度可达30~50kb,可直接用于PCR、Southern-blot和各种酶切反应。
- 从十几个配方中优选出的红细胞裂解液配方,裂解快速完全,客户可根据需要选择购买。
- 典型的产量200μL全血可提取出3~12μg基因组DNA。
组分 | 50T | 100T | 200T |
平衡液 | 5mL | 10mL | 20mL |
缓冲液BB | 10mL | 20mL | 40mL |
结合液CB | 15mL | 30mL | 60mL |
抑制物去除液IR | 25mL | 50mL | 100mL |
漂洗液WB | 13mL | 25mL | 50mL |
洗脱缓冲液EB | 15mL | 15mL | 15mL×2 |
蛋白酶K溶液(20mg/mL) | 1mL | 1mL×2 | 1mL×4 |
吸附柱AC | 50个 | 100个 | 200个 |
收集管(2mL) | 50个 | 100个 | 200个 |
保存:室温,有效期1年。
- 结合液CB或者抑制物去除液IR低温时可能出现析出和沉淀,可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解,恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。
- 蛋白酶K保存在即用型甘油缓冲液中,常温运输。收到后,不超过25℃室温至少保存6个月,4℃保存12个月,-20℃保存2年。
- 避免试剂长时间暴露于空气中发生挥发、氧化、pH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。
- 第一次使用前请先在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇,充分混匀,加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇,以免多次加入!
- 所有的离心步骤均在室温完成,使用转速可以达到13000rpm的传统台式离心机,如Eppendorf 5415C或者类似离心机。
- 不同样品尤其疾病样品中白细胞数量差异可能非常大,因此产量的个体差异也可能非常大。
- 需要自备异丙醇。
- 开始实验前将需要的水浴先预热到70℃备用。
- 为了最佳效果,最好使用新鲜血液标本或者4℃存放少于3天的标本,不要使用反复冻融超过3次的标本,否则会严重降低产量。
- 洗脱液EB不含有螯合剂EDTA,不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱,但应该确保批pH大于7.5,pH过低影响洗脱效率。用水洗脱DNA应该保存在-20℃。DNA如果需要长期保存,可以用TE缓冲液洗脱(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH8.0),但是EDTA可能下游酶切反应,使用时可以适当稀释。
- 取200μL新鲜、冷冻或加入各种抗凝剂的血液,放入1.5mL离心管。
- 如果全血起始量小于200μL,则用缓冲液BB补足到200μL。如果起始量介于200μL~300μL之间,则后续操作需要按照比例增加试剂用量。如果起始量介于300μL~1mL之间,则需要先进行红细胞裂解操作(见本说明书后附录)。
- 如果处理血样为禽类、鸟类、两栖类或更低级生物的抗凝血液,其红细胞为有核细胞,因此处理量5~20μL,可加缓冲液BB补足到200μL后进行后续步骤。
- 如果全血起始量小于200μL,则用缓冲液BB补足到200μL。如果起始量介于200μL~300μL之间,则后续操作需要按照比例增加试剂用量。如果起始量介于300μL~1mL之间,则需要先进行红细胞裂解操作(见本说明书后附录)。
- 加入20μL蛋白酶K (20mg/mL)溶液,充分混匀,再加入200μL结合液CB,立刻涡旋振荡充分混匀,在70℃放置10分钟。溶液应变清亮(但颜色偏黑色)。
- 可选步骤,一般不需要:如果RNA残留较多,需要去除RNA,可以在加入200μL结合液CB前加20μL RNase A(25mg/mL)溶液,振荡混匀,室温放置5~10分钟。
- 平衡液预处理吸附柱备用:使用平衡液预处理硅胶膜吸附柱为必做步骤,具体方法参见附录参考“附录2:关于平衡液的使用”。
- 可选步骤,一般不需要:如果RNA残留较多,需要去除RNA,可以在加入200μL结合液CB前加20μL RNase A(25mg/mL)溶液,振荡混匀,室温放置5~10分钟。
- 冷却后加入100μL异丙醇,立刻涡旋振荡充分混匀,此时可能会出现絮状沉淀。
- 上述步骤中立刻涡旋或者吹打充分混匀非常重要,混匀不充分严重降低产量,必要时如样品粘稠不易混匀时可以涡旋振荡15秒混匀。
- 将上一步混合物(包括可能有的沉淀)加入一个吸附柱AC中,(吸附柱放入收集管中)13000rpm离心30~60秒,倒掉收集管中的废液。
- 加入500μL抑制物去除液IR,12000rpm离心30秒,弃废液。
- 加入600μL漂洗液WB(请先检查是否已加入无水乙醇!),12000rpm离心30秒,弃掉废液。
- 加入600μL漂洗液WB,12000rpm离心30秒,弃掉废液。
- 将吸附柱AC放回空收集管中,13000rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
- 取出吸附柱AC,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加100μL洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65~70℃水浴中预热效果更好),室温放置3~5分钟,12000rpm离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,室温放置2分钟,12000rpm离心1分钟。
- 洗脱体积越大,洗脱效率越高,如果需要DNA浓度较高,可以适当减少洗脱体积,但是最小体积不应少于50μL,体积过小降低DNA洗脱效率,减少DNA产量。
- DNA可以存放在2~8℃,如果要长时间存放,可以放置在-20℃。
附录1:以300μL、1mL全血举例红细胞裂解操作
- 吸取900μL红细胞裂解液到一个1.5mL离心管或者3mL红细胞裂解液到一个15mL离心管。(红细胞裂解液可向本公司购买)
- 将抗凝全血(使用前回复到室温)颠倒混匀后,吸取300μL全血和1mL全血分别加到上述1.5mL和15mL离心管中,颠倒6~8次,并倒置轻弹管壁,确保充分混匀。
- 室温放置10分钟(期间应该颠倒轻弹混匀数次,帮助裂解红细胞)。
- 12000rpm离心20秒(对于1.5mL离心管)或2000~3000rpm离心5分钟(对于15mL离心管),倒弃红色上清,并小心的尽可能多的吸弃上清(注意不要吸到管底的细胞团),留下完整的管底白细胞团和大约10μL的残留上清。
- 离心后在管底应该见到白色的白细胞团,也可能有一些红细胞残片和白细胞团在一起,但是如果看到的是大部分的红色细胞团,说明红细胞裂解很不充分,应该再加入红细胞裂解液重悬细胞团后重复步骤3、4。
- 加入200μL缓冲液BB涡旋振荡重悬白细胞团,充分分散白细胞团。
- 其中由于肝素抗凝血的白细胞沉淀团很难打散重悬,影响后续实验裂解效果,建议选用非肝素的抗凝剂收集血液标本。
- 现在可以按照操作步骤提取全血基因组DNA了。
附录2:关于平衡液的使用:
- 介绍:核酸吸附硅胶膜柱子长期放置过程中会同空气中的电荷/尘埃发生反应而影响其核酸的结合能力。硅胶柱经平衡液预处理后可大大减少柱子中硅胶膜的憎水基团,提高核酸的结合能力。从而提高硅胶柱子回收效率或者产量。平衡液是强碱性溶液,若不小心碰到,请用大量自来水清洗。用完后需盖紧瓶盖,以免接触空气。室温保存。在保存过程中可能有沉淀生成,请加热至37℃使沉淀完全消失。
- 使用方法:取一个新的硅胶膜吸附柱子装在收集管中,吸取100μL的平衡液至柱子中。13000rpm离心1分钟,倒掉收集管中废液,将吸附柱子重新放回收集管。此时平衡液预处理柱子完毕。接后续的操作步骤。
问题 | 分析 |
标本中含有血凝块 |
|
红细胞裂解不完全 |
|
DNA产量低 |
|
DNA长度小于20kb |
|
未见到蛋白沉淀 |
|
A260/A280<1.6 |
|
DNA沉淀难以重新溶解水化 |
|
下游酶切切不开 |
|
相关搜索:全血基因组DNA快速提取试剂盒,全血DNA提取,基因组DNA小提,gDNA提取,Whole blood genomic DNA extraction kit